살충제의 내분비계장애작용에 관한 연구

김순선, 곽승준, 이규식, 손경희, 김소희, 이이다, 박철훈, 정의배***,

강진석**, 장동덕**, 신재호*, 김형식*, 문현주*, 강일현*, 김태성*,

한순영*, 박귀례, 하광원, 최광식

특수독성부 생식독성과, *내분비독성과,

**일반독성부 조직병리과, ***충북대학교 수의과대학

Study on Endocrine Distrupting Actions of Pesticides

Soon Sun Kim, Seung Jun Kwack, Gyu Seek Rhee, Kyung Hee Sohn,

So Hee Kim, Rhee Da Lee, Chul Hoon Park, Eui Bae Jeung3,

Jin Seok Kang2, Dong Deuk Jang2, Jae-Ho Shin1, Hyung Sik Kim1,

Hyun Ju Moon1, Il Hyun Kang1, Tae Sung Kim1, Soon-Young Han1,

Kui Lea Park, Kwang Won Ha and Kwang Sik Choi

Reproductive & Developmental Toxicology Division,

1Endocrine Toxicology Division,

2Histopathology Division

National Institute of Toxicological Research,

3College of Veterinary Medicine, Chungbuk National University

Abstract

Pyrethroid insecticides are the developed classes of insecticides due to its high activity against insects, and relatively low mammalian toxicity compared to other insecticide classes.  These insecticides are now the most widely used agents for indoor pest control, providing potential for human exposure. So far, only a few  studies of estrogenic/anti-estrogenic activity of pyrethroid insecticide were reported. However, estrogenic or antiestrogenic potential of pyrethroid insecticides has been little known in both in vivo and in vitro as yet. Therefore, we examined the estrogenic/antiestrogenic activity of several pyrethroid insecticides using uterotrophic assay and expression of calbindin-D9K (CaBP-9K) mRNA in immature SD female rats. Also, E-screen assay using a MCF-7 human breast carcinoma cell was performed. Eighteen-day old SD female rats were treated with 7 pyrethroids insecticides, permethrin, cypermethrin fenvalerate, sumithrin, tetramethrin, deltamethrin, bioallethrin at dose levels of 5 to 800 □/□/day for 3 consecutive days. Permethrin treatment resulted in increases in uterine and vaginal weights at all doses tested and dose of 800 □/□/day showed statistically significant increase in uterine weight. Also, permethrin led to statistically significant induction of calbindin-D9K mRNA expression in 5□/□ treatment group. Cypermethrin had tendency to increase in uterine and vaginal weights, whereas co-treatment with E2, a positive control significantly decreased E2-induced uterine and vaginal weights at a dose of 5 □/□/day cypermethrin induced calbindin-D9K mRNA expression at doses over 100□/□/day and co-treatment with E2 showed enhancement of E2-induced calbindin-D9K mRNA expression. Tetramethrin decreased uterine and vaginal weights at all doses tested and showed statistically significant decrease at a dose of 800 □/□/day. Tetramethrin inhibited calbindin-D9K mRNA expression and reduced E2-induced calbindin-D9K mRNA expression at all doses tested except for 100 □/□/day. These results demonstrated that permethrin and cypermethrin acts like estrogen agonist in the in vivo test, whereas tetramethrin has antiestrogenic activity and suggest that exposure to these pyrethroid insecticides may contribute to endocrine dysfunction, reproductive and developmental impairments.

Key words : pyrethroid insecticides, immature SD female rats, uterotrophic assay, E-screen assay, Calbindin-D9K (CaBP-9K) mRNA

서론

세계야생보호기금(WWF)이 내분비계 장애물질로 분류한 유기인제와 유기염소제 살충제는 내분비 기능과 생식기계에 영향을 미치는 것으로 보고되어 있다. 그러나, 이러한 살충제에 비해 독성이 적다고 하여 개발된 pyrethroid계 살충제는 가정용 해충제거제로 널리 사용되고 있어 인체노출 가능성이 매우 크나, 이들 물질에 대하여는 에스트로겐 활성 등에 관한 몇몇 in vitro 연구결과가 보고되어 있을 뿐 내분비계 장애작용 여부가 정확하게 규명되어 있지 않다. Pyrethroid계 살충제는 자연계에 존재하는 pyrethrin의 합성유도체로서 □-cyano group 함유 및 □-aminobutyric acid(GABA) 수용체와의 결합여부에 따라 typeⅠ과 Ⅱ의 두 가지로 분류되고 있으며 □-cyano group을 가지고 있지 않아 GABA 수용체와 결합하지 못하는 typeⅠ pyrethroid계 살충제로는 permethrin과 fenvalerate가 대표적이며, cypermethrin과 deltamethrin은 □-cyano group을 함유하고 있는 typeⅡ pyrethroid계 살충제에 속한다. 이들 typeⅠ과 Ⅱ pyrethroid계 살충제는 모두 신경의 sodium channel 막 전위에 영향을 주어 지각신경 마비, salivation, 경련 등 신경손상을 일으켜 살충효과를 나타낸다(Narahashi 등, 2000, Park 등, 2000). Pyrethroid계 살충제의 신경손상 효과는 해충뿐 아니라 포유동물에서도 동일하게 나타나므로 pyrethroid계 살충제에 오랫동안 지속적으로 노출될 경우, 인간에서도 독성을 일으킬 가능성을 제시한다. 이러한 pyrethroid는 해충을 제거하기 위해 전세계적으로 가장 많이 사용되고 있어 인체노출 가능성이 매우 크다. 본 연구에 사용한 pyrethroid계 살충제의 구조는 Table 1에 나타내었다. Garey 등(1998)은 sumithrin, fenvalerate, permethrin 등의 pyrethroid계 살충제를 인간 유방암 세포주인 MCF-7 cell에 처리 후, 에스트로겐성 또는 안티에스트로겐성 작용 여부를 조사하고자 PS2 유전자 발현과 MCF-7 세포의 증식을 측정한 결과, sumithrin과 fenvalerate는 통계적으로 유의성은 없었지만 PS2 유전자 발현을 유도하고 MCF-7 세포의 증식을 증가시켰으며 permethrin은 MCF-7 세포의 증식을 현저하게 증가시켰다고 보고하였다. 그러나, 지금까지 pyrethroid계 살충제에 대한 해충제거 효과 및 포유동물에서의 신경독성 등에 대하여는 비교적 많은 보고가 있지만(Barlow 등, 2001, Moore 등, 2001, Sumida 등, 2001), 이들 물질의 내분비계 장애작용에 대한 연구보고는 매우 미비한 실정이다. 본 연구에서는 국내에서 유통되고 있는 살충제에 함유되어 있는 pyrethroid계 살충제를 중심으로 미성숙 랫드를 사용한 자궁비대 반응시험, calbindin-D9K 유전자 발현 시험, E-screen assay 등을 실시하여 에스트로겐성 작용여부를 조사하였다.

재료 및 방법

1. 실험동물

실험동물은 식품의약품안전청, 국립독성연구소에서 생산된 미성숙 SD계 암컷 랫드(18일령)를 사용하였다. 모든 실험동물은 실험기간동안 식품의약품안전청의 실험동물사용 규정에 따라 온도 23±2℃, 상대습도 55±5%, 1일 12시간 명암주기 조건하에서 관리 되었으며 사료와 물(수도물)은 자유로이 섭취할 수 있도록 하였다.

2. 시험물질

17□-estradiol, HEPES, EDTA, dithiotreitol, corn oil, dimethylsulfoxide(DMSO), sulforhodamine-B, trisma base 등 실험에 사용한 일반시약은 Sigma Chemical Co.(St. Louis, MO, U.S.A.)에서 구입하였고 cypermethrin, permethrin, deltamethrin, tetramethrin, sumithrin, bioallethrin 및 fenvalerate 등의 pyrethroid계 살충제는 Supelco社로부터(Bellefonte, PA, U.S.A.) 구입하였으며 DMEM및 fetal bovine serum(FBS)은 Gibco BRL社 제품을 사용하였다.

3. 세포 및 배지

사람유방암세포주인 MCF-7 세포는 Dr. Soto, A.M.(Tufts University, MA)로부터 분양 받았다. MCF-7 cell(BUS cell)은 5% fetal bovine serum(FBS), 1mM sodium pyruvate 및 7.5% NaHCO3이 함유된 Dulbecco's modification of Eagle's medium(DMEM)배지를 가하여 5% CO2, 37℃ 배양기에서 순차적으로 계대배양 하였다.

4. 자궁비대반응시험(Uterotrophic assay)

자궁비대 반응시험에서는 생후 18일의 미성숙 암컷 랫드(교배일을 0일로 산정하였음)를 사용하였으며, 시험물질 투여 1일 전에 실험동물자원실로부터 공급받아 1일간 실험실 환경에 적응시킨 후, 시험군을 용매대조군, 양성대조군, 시험물질 단독투여군 및 양성대조물질 (17□-estradiol(E2))과의 병용투여군으로 분리하였다. 모든 시험물질은 corn oil에 현탁하여 3일간(19, 20, 21일) 피하주사 하였다. 투여량은 E2는 3□/kg, 시험물질은 5, 10, 50, 100, 200, 800 □/□으로 하였으며, 병용투여군은 E2와 시험물질 각 농도를 혼합하여 투여하였다. 투여액량은 5 □/□로 하였다. 투여액량은 매일 체중을 측정하여 체중에 따라 산출하였으며 시료는 투여직전에 조제하였다. 투여는 매일 동일한 시간에 실시하였으며 마지막 투여 후 24시간에 모든 동물을 투약 순서대로 사멸하여 자궁, 질, 난소를 적출하여 지방을 제거하고 중량을 측정하였다(OECD, 1999, Newbold 등, 2001). 무게를 측정한 조직은 10% 중성 포르말린 액에 고정하여 조직절편 슬라이드를 제작하여 H&E 염색 후 조직학적 관찰을 실시하였다.

5. Cabindin-D9K 유전자발현 측정시험

시험물질을 자궁비대반응시험과 동일한 용량 및 방법으로 3일간 연속하여 피하 투여하고 마지막 투여 후 24시간에 모든 동물을 사멸하여 자궁을 적출하여 실험 전까지 액체질소에 저장하였다. 저장된 자궁을 cold-sterile 0.9% NaCl로 세척한 후 Trizol(Life Technologies, inc)을 사용하여 total RNA를 추출하였다. RNA는 65℃에서 15분간 방치하여 denature시키고, 각각의 total RNA를 10□씩 1% agarose gel에 loading하여 electrophoresis(90분간, 110V)를 실행하였으며 이 때 total RNA의 양을 검사하기 위하여 indicator로 18S rRNA를 사용하였다. 그 후 RNA는 Vacuum blotter(Bio-Rad, US)를 사용하여 agarose gel로부터 nylon membrane으로 transfer하였다(Krisinger 등, 1992, 1995).

6. E-screen assay

시험 하루 전 시험에 사용될 세포의 배지를 교환하고, 시험 당일 세포가 들어 있는 25□ 플라스크의 배지를 흡인 제거한 다음, phosphate buffered saline(PBS) 완충액으로 1회 세정하였다. 0.25% 트립신 용액을 플라스크 당 500□ 첨가하여 MCF-7 세포가 플라스크 바닥에서 분리되면(1∼2분 정도) 배지 5□를 넣어서 피펫팅하였다. 배지를 15□ 원심분리관(FALCON #352097)으로 옮겨 원심 분리시켜(295×g, 5분) 상등액을 흡인·제거한 다음, 세포가 남아 있는 윈심분리관에  배지를 넣고 피펫팅하여 세포를 단일화시켜 세포수를 측정하였다. 5×103 cells/well로 96 well 배양판(Falcon #353072, Non-pyrogenic)에 분주한 후(well당 배지량 100□) 배양판을 천천히 흔들어 세포가 균일하게 분산되도록 하고 5% CO2, 37℃로 조절된 배양기에서 24시간 배양시킨 후, well에 들어 있는 배지를 흡인, 제거하였다. 혈청에 함유된 세포증식인자를 제거한 Charcoal-dextran처리 FBS(CDFBS)를 5% 함유한 DMEM 배지 90□를 well에 넣고 시험 물질의 각 농도별로 10□씩 well에 첨가하였다. 이때 용매로 사용한 DMSO의 최종 농도를 0.5%가 되도록 조절하였다. 시료가 첨가된 96 well plate를 5% CO2, 37℃로 조절된 배양기에서 6일간(144시간) 배양한 후, sulforhodamine-B(SRB) assay로 세포 수를 측정하였다. MCF-7 cell의 증식 정도를 측정하기 위하여 세포 단백질의 음이온과 SRB의 양이온이 결합하여 발색하는 원리를 이용한 SRB assay를 이용하였다(Villalobos 등, 1995). 6일간 배양 후 96well 배양판의 배지를 흡인·제거하고 4℃에 보관된 10% Trichloroacetic acid(TCA)를 well당 100□씩 첨가하고 4℃에서 1시간 정치하여 세포를 고정하였다. 고정액을 제거하고 수세한 후 종이타월로 물기를 완전히 흡수시켜 상온에서 건조시켰다. 건조된 배양판에 0.4% SRB(1% acetic acid에 용해)를 well당 50□씩 가하여 상온에서 30분 정도 염색한 후, 100□의 1% acetic acid로 4회 세척하여 상온에서 건조시켜 10mM Tris-buffer(pH 10.5)를 well당 100□씩 분주한 다음 550nM에서 흡광도를 측정하였다.

7. 통계학적 분석

시험결과는 대조군과 비교해서 분석하였다. SigmaStat 프로그램을 사용하여 ANOVA(one way analysis of variance)와 Dunnet's test를 실시하여 통계처리 하였으며, p<0.05인 경우 유의성이 있다고 판정하였다.

결과

1. 자궁비대반응시험

Pyrethroid계 살충제에 대한 자궁비대반응시험 결과는 Fig. 1부터 Fig. 7까지 나타내었다. 미성숙 암컷 랫드(18일령)에 pyrethroid계 살충제를 3일간 피하주사한 후, 자궁 및 질을 적출하여 그 무게를 측정한 결과, permethrin은 투여한 모든 용량에서 자궁과 질의 무게를 증가시켰으며, 고용량 투여군(800□/□/day)에서는 대조군에 비해 통계학적으로 유의한 차이를 나타내었다(Fig. 6). Cypermethrin은 자궁과 질의 무게를 증가시키는 경향을 나타내었으나, E2와 병용투여 시에는 E2에 의해 증가된 자궁과 질의 무게를 현저하게 감소시켰으며, 특히 최저용량(5□/□/day)에서 질의 무게가 양성대조물질인 E2군에 비해 통계학적으로 유의하게(p<0.05) 감소되었다(Fig. 7). 한편, tetramethrin은 투여한 모든 용량에서 자궁과 질의 무게를 감소시켰으며 고용량 투여군(200 또는 800 □/□/day)에서는 대조군에 비해 통계학적으로 유의한 차이를 나타내었다(p<0.05)(Fig. 1). Tetramethrin은 E2와 병용투여 시, 자궁무게에서는 E2군에 비해 별다른 영향을 나타내지 않았으나, 모든 용량에서 질무게를 감소시켰으며 5, 10, 100 □/□/day 병용투여군은 E2에 의해 촉진된 질무게가 현저하게 감소되었다(p<0.05).

2. Cabindin-D9K 유전자 발현

Cabindin-D9K 유전자 발현을 northern blot analysis를 통하여 calbindin-D9K mRNA 함량을 측정하였다. Permethrin은 최저용량(5 □/□/day)에서 calbindin-D9K 발현을 통계학적으로 유의하게 증가시켰으며, 양성대조물질(E2)와 병용투여 시에는, 최고용량(800 □/□/day)을 제외한 모든 용량에서 E2에 의해 유도된 calbindin-D9K mRNA 발현을 E2군에 비해 통계학적으로 유의하게 증가시켰다(Fig. 8). Cypermethrin은 100 □/□/day이상의 용량에서 calbindin-D9K mRNA 발현을 유도하였으며, 모든 용량에서 E2에 의한 calbindin-D9K mRNA 발현을 촉진하였고, 저용량(5 □/□/day)과 고용량(200 및 800 □/□/day) 투여군은 E2군에 비해 통계적으로 유의하게 calbindin-D9K mRNA 발현을 증가시켰다(Fig. 9). Bioallethrin은 유의성은 없었지만 모든 용량에서  calbindin-D9K mRNA 발현을 감소시켰으나, E2와 병용투여 시에는 E2에 의한  calbindin-D9K mRNA 발현을 증가시키는 경향을 나타내었다(Fig. 10). Tetramethrin 투여 시에는 100 □/□/day 투여군을 제외한 모든 군에서 calbindin-D9K mRNA 발현을 유도하였으며 E2에 의한 calbindin-D9K mRNA 발현을 증가시켰다(Fig. 12).

3. 조직학적 관찰결과

Pyrethroid계 살충제 투여에 따른 자궁, 질 및 난소의 형태에 미치는 영향을 관찰하고자 H&E 염색을 통하여 이들 장기에 대한 조직병리검사를 실시한 결과, cypermethrin은 최저용량(5 □/□/day)에서 E2에 의해 증가된 자궁세포의 비후와 질의 각화를 E2에 비해 현저하게 감소시켰다.

4. E-screen assay

MCF-7 (BUS)세포를 이용한 세포증식 시험(E-screen)의 양성대조물질로 사용되는 17□-estradiol(E2)의 에스트로겐 활성을 측정하여 우리가 확립한 시험법을 검증하고 양성대조물질의 농도를 결정하였다.  E2의 가장 높은 증식활성은 10-10M과 10-9M에서 나타났으며, 10-8M부터 감소하였다.  이후 양성대조물질인 E2의 농도를 10-10M로 정해 각 시험군과 비교하였다.

Pyrethroid계 살충제 7종류 bioallethrin, cypermethrin, deltamethrin, fenvalerate, permethrin, sumithrin 및 tetramethrin에 대한 인체 유방암세포인 MCF-7 (BUS)세포의 증식활성능을 검색하여 에스트로겐 활성을 조사하였다.  용매로 사용된 DMSO (0.5%) 단독 처리군 및 시험물질 중 bioallethrin, deltamethrin, fenvalerate, tetramethrin는 본시험에 이용된 어떤 농도에서도(10-11∼10-5M) 세포증식성을 보이지 않아 에스트로겐 활성이 없는 것으로 관찰되었다.  Sumithrin의 경우, 10-7∼10-5M의 농도에서 농도의존적으로 세포증식을 보여 에스트로겐성 활성이 있는 것으로 생각되었다.  그리고, 최대 세포증식상태(10-5M)의 세포수는 E2처리군(10-10M)의 최대 세포증식상태의 세포수에 비해  50% 수준이었다.  Cypermethrin과  permethrin 처리시는 실험시마다 차이를 보여 세포증식성이 관찰되지 않는 경우도 있었지만, 세포증식성이 관찰되는 경우도 있었다.  관찰된 경우에도, 농도의존성이 보이지 않았고, 증식성이 관찰된 농도도 일정하지 않아 일관성 있는 에스트로겐 활성이 검출되지 않았다.

고찰

지금까지, permethrin, cypermethrin을 포함한 pyrethroid계 살충제의 에스트로겐 또는 항에스트로겐 활성에 관한 연구 결과는 거의 없으며 보고된 결과 또한, 서로 상반된 결과를 보이고 있어 이에 대한 고찰 필요성을 제시한다. 따라서, 본 연구는 국내에서 의약외품으로 판매가 허가되어 주로 가정용 해충제거제로 사용되고 있는 pyrethroid계 살충제를 중심으로 살충제의 에스트로겐 또는 항에스트로겐 활성을 검색하여 이들 물질의 내분비계 장애작용 여부를 조사하고자 수행되었다. Permethrin과 cypermethrin은 MCF-7 세포를 사용한 리포터 유전자 측정시험에서 용량 의존적으로 유의하게 luciferase 활성을 증가시켰다. 그러나, 본 연구결과는 동일 시험에서 이들 두 물질을 포함한 pyrethroid계 살충제가 luciferase 활성에 별다른 영향을 미치지 않음을 보고한 Saito K 등의 연구결과와 상반된다.  또한, permethrin과 cypermethrin은 dot blot과 Northern blot 실시 결과, 에스트로겐 의존성 calbindin-D9k 유전자 발현을 유도하여 이들 두 pyrethroid의 에스트로겐 활성 가능성을 증가시킨다. 특히, 전세계적으로 에스트로겐 또는 항에스트로겐 활성을 연구한 동물 실험 결과는 보고된 바 없다. 본 연구에서 미성숙 암컷 랫드를 사용한 자궁비대 반응시험 결과, permethrin과 cypermethrin은 에스트로겐 활성을 보인 반면, tetramethrin은 항에스트로겐 활성을 나타내었다. 또한, permethrin과 cypermethrin은 자궁내 에스트로겐 수용체 (ER□) 함량을 유의적으로 감소시켜 이들 물질의 에스트로겐 활성이 ER□를 매개할 가능성을 제시하였는데, Zou 등이 permethrin의 에스트로겐 활성은 c-Neu 경로를 매개하여 이루어짐을 보고한 것을 고려할 때, 이들 pyrethroid계 살충제의 에스트로겐 또는 항에스트로겐 작용에 대한 심도있는 기전 연구가 요망된다. 결론적으로, permethrin과 cypermethrin은 본 연구에서 사용한 모든 측정법에서 에스트로겐 활성을 보인 반면 tetramethrin은 항에스트로겐 활성을 나타내었으며, 그 밖의 다른 pyrethroid계 살충제도 용량 의존성은 관찰되지 않았지만, 에스트로겐 또는 항에스트로겐 활성을 나타내었는데, 이는 pyrethrod계 살충제가 랫드에서 에스트로겐 또는 안티에스트로겐 활성을 통하여 내분비계 장애작용을 나타냄을 의미한다. 이러한 결과는 이들 물질의 임신 중 또는 차산자 노출이 생식·발생 과정에 영향을 미칠 가능성을 제시하는 것으로 이에 대한 관련 연구를 수행 할 계획이다.

본 시험에서는 pyrethroid 살충제의 에스트로겐 활성을 평가하기 위하여 인체 유방암세포인 MCF-7 (BUS) 세포를 이용하여 E-screen assay를 실시하였다.  본 시험에 사용된 7 종류의 살충제성분(bioallethrin, cypermethrin, deltamethrin, fenvalerate, permethrin, sumithrin, tetramethrin) 중 bioallethrin, deltamethrin, fenvalerate, tetramethrin는 세포증식이 일어나지 않아 에스트로겐 활성이 없는 것으로 사료되었으며, sumithrin의 경우 10-7∼10-5M에서 에스트로겐 활성을 보였다.  Cypermethrin 및 permethrin처리시, 실험때마다 다른 결과를 보여 세포증식성이 나타난 경우와 나타나지 않는 경우가 있었으며, 세포증식성이 관찰된 경우에서도 증식성이 관찰된 농도가 일정하지 않았고 농도의존성이 관찰되지 않아 E-screen assay로는 cypermethrin 및 permethrin의 에스트로겐 활성검색이 어려운 것으로 사료되었다.  한편 오 및 정(2001)은 MCF-7 (BUS) 세포를 이용하여 fenvalerate, allethrin 및 permethrin의 에스트로겐 활성을 조사한 결과, allethrin과 permethrin 처리시는 에스트로겐 활성을 보이지 않았으나, fenvalerate의 경우 세포증식성이 관찰되어 partial agonist로서 작용한다고 보고하였다. 본시험의 경우, fenvalerate는 에스트로겐 활성을 보이지 않아 본 시험의 결과와 차이를 보였다.  오와 정(2001)의 시험의 경우, fenvalerate는 최대 세포증식상태(10-5M)의 세포수는 E2처리군(10-10M)의 최대 세포증식상태의 세포수에 비해 약 11%수준으로 아주 미약하였다.  이와 같이, 동일한 물질을 같은 세포계를 이용하여 실험한 경우에도 미약한 에스트로겐 활성을 가진 물질은 실험실에 따라 다른 결과를 나타낼 수 있으므로 이러한 차이를 줄일 수 있는 실험조건 통일 등의 새로운 시도가 필요한 것으로 생각된다. 반면, Go 등(1998)은 permethrin은 10-4M, sumithrin은 10-5M, fenvalerate는 10-4M에서 MCF-7세포가 가장 많이 증식되었다고 보고하였고, Garey 등(1998)은 Ishikawa Var-1에서 sumithrin과 fenvalate는 10-5M에서 가장 높은 alkaline phosphatase활성을 보였다고 하였다.  본 시험에서 sumithrin의 경우는, Go 등(1998) 및 Garey 등(1998)의 보고와 같이 에스트로겐 활성이 관찰되었으나 최고 증식을 보이는 농도가 다른 시험보다 낮았고, fenvalerate의 경우는 다른 시험과 달리 에스트로겐 활성을 보이지 않았다.  본 시험 결과와 에스트로겐 활성을 보이는 물질과 농도범위가 다른 이유로 시험계 및 시험법에 의한 차이가 있을 수 있는 것으로 추정된다.  우리는 Soto에 의해 변조된 MCF-7(BUS)세포를 사용하였는데, Go 등(1998)은 ATCC에서 공급된 MCF-7(ATCC) 세포를 사용하여 이에 따른 세포반응 정도의 차이도 있을 수 있는 것으로 생각된다.  한편, Saito 등(2000)은 cypermethrin, permethrin, fenvalerate 등이 Luciferase reporter gene assay, yeast two-hybrid assay, competitive ligand binding assay에서 에스트로겐 활성이 없다고 보고하였다.  본시험에서도 fenvalerate의 경우, 에스트로겐성 활성을 보이지 않았다. 이상에서와 같이 본시험 결과 및 다른 연구자들의 보고를 비교해 볼 때 in vitro에서의 pyrethroid계 살충제의 에스트로겐 활성은 일치되지 않는 점이 많아 에스트로겐 활성이 거의 없거나 있더라도 매우 미약한 것으로 사료되며 보다 명확한 규명을 위해서는 보다 민감한 엔드포인트를 사용하여 이러한 현상을 더 검증할 필요가 있을 것으로 사료된다.

국문요약

Pyrethroid계 살충제는 기존 유기염소제 또는 유기인제 살충제에 비하여 해충제거 효과는 큰 반면, 인간을 포함한 포유동물에서는 비교적 독성이 적다고하여 개발된 천연 pyrethroid의 합성 유도체이다. 이러한 이유로 pyrethroid계 살충제는 집안 내의 살충목적으로 많이 사용되어 인간에게 노출될 잠재성이 크다. 지금까지 pyrethroid계 살충제에 대한 에스트로겐성/안티에스트로겐성 연구는 몇몇의 연구만이 보고되어 있다. 그러나, pyrethroid계 살충제의 in vitro 또는 in vivo에서의 에스트로겐성/안티에스트로겐성에 대한 영향은 거의 알려져 있지 않다. 그러므로 본 연구에서는 몇 종류의 pyrethroid계 살충제의 에스트로겐성/안티에스트로겐성을 조사하기 위하여 미성숙 암컷 SD계 랫드를 이용한 자궁비대반응시험과 calbindin-D9K(CaBP-9K) 유전자 발현 시험, 또한 인간 유방암 세포주인 MCF-7 세포주를 이용한 E-screen assay를 수행하였다. 18일령의 암컷 SD계 랫드에 permethrin, cypermethrin, fenvalerate, sumithrin, tetramethrin, deltamethrin 및 bioallethrin등의 7가지 물질을 5□/□/day에서 800□/□/day의 농도로 3일 동안 연속적으로 투약하였을 때, permethrin의 경우 모든 농도에서 자궁과 질의 무게를 증가시켰고, 특히 800□/□/day의 농도에서 유의적인 자궁 무게의 증가를 나타내었을 뿐 아니라 5□/□/day의 농도에서 유의적으로 calbindin-D9k mRNA의 발현을 유도하였다. Cypermethrin은 전 농도에서 자궁과 질의 무게를 증가시키는 경향을 나타내었으나 양성대조군과 비교 시 5□/□/day에서는 E2에 의해 유도되는 자궁과 질의 무게를 감소시켰다. 또한 calbindin-D9K mRNA 발현은 5□/□/day와 100□/□/day 이상의 농도에서 발현을 유도하였다. Tetramethrin은 모든 농도에서 자궁과 질 무게를 감소시켰는데, 특히 800□/□/day의 농도에서는 통계학적으로 유의성을 보여주었고, 100□/□/day의 농도를 제외한 모든 농도에서 calbindin-D9K mRNA의 발현을 억제시켰으며, E2에 의해 유도되는 발현 정도 또한 감소시킴을 알 수 있었다. 이상의 pyrethroid계 살충제의 에스트로겐/항안드로겐성을 조사한 결과, tetramethrin은 항안드로겐성을, permethrin 및 cypermethrin은 에스트로겐성을 보였다.

참고문헌

Barlow, S.M., Sullivan, F.M., and Lines, J. : Risk assessment of the use of deltamethrin on bednets for the prevention of malaria. Food and Chemical Toxicol., 39, 407-422, 2001.

Garey, J., and Wolff, M.S. : Estrogenic and antiestrogenic activities of pyrethroid insecticides. Biochem. Biophys. Res. Commun., 251, 855-859, 1998.

Go, V., Garey, J., Wolff, M.S., and Pogo, B.G. : Estrogenic potential of certain pyrethroid compounds in the MCF-7 human breast carcinoma cell line. Environ. Health Perspect., 107, 173-177, 1999.

Krisinger, J., Dann, J.L., Currie, W.D., Jeung, E.B., and Leung, P.C. : Calbindin-D9k mRNA is tightly regulated during the estrus cycle in the rat uterus. Mol. Cell Endocrinol., 86, 119-123, 1992.

Krisinger, J., Dann, J.L., Jeung, E.B., and Leung, P.C. : Calbindin-D9k gene expression during pregnancy and lactation in the rat. Mol. Cell Endocrinol., 88, 119-128, 1992.

Krisinger, J., Jeung, E.B., Simmem, R.C., and Leung, P.C. : Porcine calbindin-D9k gene: expression in endometrium, myometrium, and placenta in the absence of a functional estrogen response element in intron A. Biol. Reprod., 52, 115-123, 1995.

Moore, A., and Waring, C.P. : The effects of a synthetic pyrethroid pesticide on some aspects of reproduction in Atlantic salmon (Salmo salar L.). Aquatic Toxicol., 52, 1-12, 2001.

Narahashi, T., Carter, DB., Frey, J., Ginsburg, K., Hamilton, B.J., Nagata, K., Roy, M.L., Song, J.H., and Tatebayashi, H. : Sodium channel and GABAA receptor-channel complex as targets of environmental toxicants. Toxicol. Lett., 82-83, 239-245, 1995.

Newbold, R.R., Jefferson, W.N., Banks, E.P., Walker, V.R., and Pena, D.S. : Cell response endpoints enhance sensitivity of the immature mouse uterotrophic assay. Reproductive Toxicol., 15, 245-252, 2001.

OECD : Validation Management Committe: Endocrine disruptors scrrening and testing, Agenda Item 5, Validation protocol for the uterotrophic assay. 1999.

Park, Y.S., Lee, D.W., Taylor, M.F.J., Holloway, J.W., Ottea, J.A., Adams, M.E., and Feyereisen, R. : A mutation Leu1029 to his in Heliothis virescens F. hscp sodium channel gene associated with a nerve-insensitivity mechanism of resistance to pyrethroid insecticides. Pesticide Biochem. Physiol., 66, 1-8, 2000.

Saito, K., Tomigahara, Y., Ohe, N., Isobe, N., Nakatsuka, I., and Kaneto, H. : Lack of significant estrogenic or antiestrogenic activity of pyrethroid insecticides in three in vitro assays based on classic estrogen receptor alpha-mediated mechanisms. Toxicol. Sci., 57, 54-60, 2000.

Sumida, K., Saito, K., Ooe, N., Isobe, N., Kaneto, H., and Nakatsuka, I. : Evaluation of in vitro methods for detecting the effects of various chemicals on the human progesterone receptor, with a focus on pyrethroid insecticides. Toxicol. Lett., 118, 147-155, 2001.

Villalobos, M., Olea, N., Brotons, J.A., Olea-Serrano, M.F., Ruiz de Almodovar, J.M., and Pedraza, V. : The E-screen assay: a comparison of different MCF7 cell stocks. Environ. Health Perspect. 103, 844-850, 1995.

오승민, 정규혁 : 피레스로이드계 살충제의 MCF7-BUS 세포에 대한 에스트로겐 및 항에스트로겐 효과. 약학회지. 제45권 6호: 694-700, 2001

Table 및 Fig

Table 1. Structures of pyrethroid insecticides

Name	Structure
Permethrin
Cypremethrin
Sumithrin
Tetramethrin
Deltamethrin
Bioallethrin
Fenvalerate

Fig. 15. Effects of 17□-estradiol on proliferation of MCF-7 human breast cancer cells. Cells were exposed for 144 hrs to 17□-estradiol in DMEM medium supplemented with 5% charcoal dextran-treated FBS serum. Cell proliferation was determined by SRB assay. Data presented are mean±SD. Asterisks indicate significant difference from the solvent control(p＠0.001).

Fig. 16. Effects of bioallethrin on proliferation of MCF-7 human breast cancer cells.  Data presented are mean±SD. Asterisks indicate significant difference from the solvent control(p＠0.001).

Fig. 17. Effects of cypermethrin on proliferation of MCF-7 human breast cancer cells. Data presented are mean±SD. Asterisks indicate significant difference from the solvent control(p＠0.001).

Fig. 18. Effects of deltamethrin on proliferation of MCF-7 human breast cancer cells. Data presented are mean±SD. Asterisks indicate significant difference from the solvent control(p＠0.001).

Fig. 19. Effects of fenvalerate on proliferation of MCF-7 human breast cancer cells. Data presented are mean±SD. Asterisks indicate significant difference from the solvent control(p＠0.001).

Fig. 20. Effects of permethrin on proliferation of MCF-7 human breast cancer cells. Data presented are mean±SD. Asterisks indicate significant difference from the solvent control(p＠0.001).

Fig. 21. Effects of sumithrin on proliferation of MCF-7 human breast cancer cells. Data presented are mean±SD. Asterisks indicate significant difference from the solvent control(p＠0.001).

Fig. 22. Effects of tetramethrin on proliferation of MCF-7 human breast cancer cells. Data presented are mean±SD. Asterisks indicate significant difference from the solvent control(p＠0.001).